میکروسکوپ های الکترونی؛ ابزاری برای آماده سازی نمونه های زیستی

میکروسکوپ های الکترونی ابزاری نیرومند و دارای قابلیت های فراوانی برای تصویر برداری‌،  آشکار سازی و ارائه اطلاعات مفید درباره  پدیده های کوچک و بسیار کوچک هستند. این ابزارها با خانواده های متفاوت و عناوینی خاص مرتبط با اساس عملکردشان مطرح می شوند که از یک سو از لحاظ ساختار و اجزای داخلی قابل بررسی و ارزیابی اند و از سوی دیگر  از لحاظ روش های آنالیز و دریافت داده ها از نمونه قابل مقایسه و مطالعه هستند.

آماده سازی و نوع نمونه ها بر اساس ساختار و عــمـلـکــرد پـــردازش اطــلاعــات از نـمــونــه مــتــفـاوت اسـت بـــه طـوریــکــه در بــعــضـی از میکـروسکـوپ‌هـای الکتـرونـی آمـاده سـازی به دشـواری و بـا شرایط خاص همراه است و در بعضی دیگر، روش های آماده سازی نمونه های بیولوژی و غیر بیولوژی متفاوت است. داده های حاصل از پردازش اطلاعات از نمونه ها، از یک مـنـظــر در ســاخـت و تــولـیــد ریــز تــراش هـا، سیستم‌های متنوع الکترونی و الکترومکانیکی اهـمـیــت خـاص دارد و از مـنـظــر دیـگـر در بــه کــارگـیــری نمـونـه هـای بیـولـوژی ( سلـولهـا، پـــروتـیـــن هــا و…) بـــرای طـــراحـــی و ســـاخــت ریـزتـراشـه‌هـای زیـسـتـی و سیستم های زیستی نانومتری نقش به سزایی را ایفا می کند.

مــیــکـــروســکـــوپ هـــای الـکـتــرونــی ابــزاری نـیـرومـنـد و دارای قـابـلـیـت هـای فـراوانی برای تصویر برداری، آشکار سازی و ارائه اطلاعات مفید درباره پدیده های کوچک و بسیار کوچک هـسـتند. ابن ابزارها با خانواده های متفاوت و عـنـاویـنـی خـاص مرتبط با اساس عملکردشان مطرح می شوند که از یک سو از لحاظ ساختار و اجـزای داخـلی قابل بررسی و ارزیابی اند و از سوی دیگر ، از لحاظ روش های آنالیز و دریافت داده ها از نمونه قابل مقایسه و مطالعه هستند.
در میکروسکوپ های الکترونی نمونه های بیولوژی و غیر بیولوژی در دو دسته مشخص و تفکیک شده مورد مطالعه قرار می گیرند. روش های آماده سازی نمونه ، برای هر دسته متفاوت و بر اساس روش کار و پردازش داده ها توسط میکروسکوپ های الکترونی مبتنی است. آماده سازی نمونه در بعضی سیستم ها با اندود سازی نمونه با سایر عناصر شکل می گیرد و در بعضی دیگر با آبگیری و تثبیت همراه است. در هر صورت برای دستیابی به داده ها از نمونه های بیولوژی و غیر بیولوژی متناسب با روش های استاندارد و قابل استناد باشد تا از یک سو اطلاعات کامل و در حداقل خطا باشند و از سوی دیگر نمونه های با ارزش و زمان آماده سازی به هدر نرفته و کار با موفقیت به انجام رسد.
اگرچه، میکروسکوپ های الکترونی شباهت های اساسی با یکدیگر دارند ولی تـفــاوت هـای قـابـل مـلاحظـه آن‌هـا بـاعـث وجـود گـونـه هـا و خـانـواده هـای مختلـف (میکروسکوپ های الکترونی روبشی، تراگسیل، کاوشی ) شده است. این تفاوت بر اساس نوع و روش دستیابی به اطلاعات همانند روش روبش، تراگسیل، کاوش است. علت وجود روش های متفاوت، بررسی و مطالعه بهتر و آسان تر و نیز هدفمند نمونه ها است.

فناوری در میکروسکوپ های الکترونی
پیش از ورود به مبحث آماده سازی نمونه ، نگاهی کلی و گذرا بر اصول و روش کار میکروسکوپ های الکترونی اگرچه مختصر امری ضروری است. میکروسکوپ‌های الکترونی براساس ساختار و روش کار میکروسکوپ های نوری ساخته شده اند و از این‌رو دارای شباهت ها و تفاوت هایی با یکدیگرند. اولین مولفه  قابل ارزیابی بین این دو گروه ، نوع منبع است که در میکروسکوپ های الکترونی ، الکترون پر انرژی و متمرکز برای دستیابی به تصویر و اطلاعات از نمونه به جای نور مورد استفاده قرار می گیرد. مـــولـفـــه دیـگـــر ، عـــدســی‌هــای هـسـتـنــد کــه در مـیـکـروسکـوپ هـای الکتـرونـی ، عـدسـی‌هـای الکترومغناطیسی با قابلیت تنظیم فاصله کانونی را دارند. با تغییر میزان جریان الکتریکی، میزان بزرگنمایی قابل کنترل است. این درحالی است که عدسی های شیشه ای در میکروسکوپ های نور با فاصله کانونی ثابت فاقد این توانایی است و در نتیجه اطلاعات قابل دسترسی محدودتری را در اختیار محققان از نمونه قرار می دهند.
چـگــونـگــی دسـتــرســی و دریـافـت داده هـا ، آشکارسازی و نمایش نتایج حاصله از نمونه، تــوســط مـیـکـروسکـوپ هـای الکتـرونـی دارای مراحل اساسی مشترک زیر هستند:
۱-جریانی از الکترون ها توسط منبع الکترونی ایجاد و با استفاده از یک پتانسیل الکتریکی مثبت به طرف نمونه شتاب داده می شود.
۲-جـریـان الـکـتـرونـی بـا کـمـک عدسی های مـغـنـاطـیـسـی و دهـانه ها به یک پرتوی تک فام ظریف و متمرکز تبدیل می شوند.
۳-پرتوی الکترونی حاصل با استفاده از یک عــدســی مـغـنــاطـیـســی در روی نـمـونـه کـانـونـی می‌شود.
۴-برخورد پرتو الکترونی به نمونه سبب بر هــم کـنــش هــای مـخـتـلفـی در داخـل نمـونـه هـا می‌شود که خود پرتو الکترونی نیز تحت تاثیر قرار می گیرد.
۵-سیگنال های حاصل از این بر هم کنش ها و آثار آن ، جمع آوری شده تا امکان دستیابی به اطلاعات با ارزش را میسر سازد[۱].
در این مراحل کلی ، نمایی مناسب از روش کار میکروسکوپ های الکترونی حاصل شد. در هر صورت ، قابلیت های ممتاز و توانایی های زیاد میکروسکوپ های الکترونی موجب عدم مـحـدودیـت در اسـتـفـاده و بـه کـارگـیـری آن هـا نـمــی‌شــود. بــه طــور کـلــی  مـهـمـتــریــن عــوامـل مـحــدود‌سـاز شـامـل:  گـران و پـرهـزیـنـه بـودن ، ظرافت و پیچیدگی کاربری ، حساسیت بعضی از مواد، نسبت الکترون های پر انرژی و دشواری آماده‌سازی نمونه در بعضی از گروه ها هستند.
گونه های متداول و معروف میکروسکوپ الـکـتـــرونـــی ، کـــه دارای زیـــر مـجـمـــوعـــه هــای گسترده‌ای نیز هستند عبارتند از : میکروسکوپ الـکـتــرونــی تــراگـسـیــل  (TEM)، میکـروسکـوپ الکترونی روبشی (SEM) و میکروسکوپ نیروی اتمی  (AFM) که در شکل ۱ ترسیمی ساده از کنش پرتو در هر یک از سه میکروسکوپ مذکور نمایش داده شده است.

میکروسکوپ های الکترونی روبشی(SEM)
میکـروسکـوپ هـای الکتـرونـی روبشـی قـادرنـد سیگنـال هـای حـاصل از برخورد الکترون ها به نمونه (الکترون های ثانویه) را به تصویری با کاربردهای متنوعی تبدیل کننـد. این دستگاه ها معمولا جهت مطالعه ساختارهای سطحی  یا نزدیک به سطح نـمــونـه‌،تهیـه تصـاویـر تـوپـوگـرافیـک ، تعییـن تـرکیـب و تصـاویـر تـرکیبـی و یـا مطـالعـه کـاتـدولـومـیـنـسـانـس اسـتـفـاده مـی شود. تصاویر در این دستگاه از آن جهت که شبیه تصاویری است که انسان با چشم می بیند ، خیلی راحت تر تفسیر می شوند [۳و۲٫]
مـعـمـولا بـرای تـهـیـه تصاویر بهینه در آنالیز میکروسکوپ های الکترونی روبشی سطوح کاملا پرداخته شده (پولیش) نیاز است. مسلما کاهش میزان آمادگی سطوح موجب کاهش کنتراست و البته کاهش میزان کیفیت تصویر خواهد شد. از طرف دیگر نمونه ها غیر مسطح دشواری های زیادی را در آنالیز در پی خواهند داشت. با این وجود ‌،  فضای بزرگی که در میکروسکوپ های الکترونی روبشی برای قرار دادن نمونه ها وجود دارد کار با کنترل های مکانیکی را آسان می سازد.
روش های تهیه نمونه های بیولوژیک برای مطالعات این سیستم بستگی زیادی به نوع نمونه دارد. بسیاری از نمونه های بیولوژیک ( خارج از بدن موجود زنده) ، به مرور زمان آب خود را از دست داده ، چروکیده و دیگر به یک بافت و ارگانیسم زنده شباهت نخواهند داشت. این مسئله باعث می شود که سبک های ویژه ای برای آماده سازی نمونه‌ها اعمال شود که به قرار زیرند:
۱-نمونه تا حد ۵ میلیمتر برش داده شود زیرا محلول های تثبیت کننده و خشک کننده به سرعت قادر به نفوذ در نمونه های ضخیم تر نیستند.
۲-نمونه تثبیت شود ، یعنی عوامل شیمیایی خاص برای پایداری ساختار نمونه در آب استفاده شود (روش های دیگر در جدول ۱آمده است.)
۳-آب نمونه گرفته شود.
۴-مواد خشک کننده از نمونه جدا شود.
۵-نمونه با لایه ای در حدود  ۲۰۰ض‌با فلزات طلا یا پالادیوم اندود شود.
۶-نمونه به یک قاب استوار و برای مشاهده آماده شود.
اساسا، تثبیت و آبگیری باعث پایداری نمونه های نرم و مرطوب می شود. در صورت عدم تثبیت و آبگیری نمونه های بیولوژیک در خلا دستگاه تغییر شکل خواهند داد. بعد از استواری بر قالب آلومینیومی (نمونه های بزرگ) یا نواری با لایه پوشانی مضاعف (نمونه های کوچک) ، نیاز به لایه پوشانی نمونه با یک لایه نازک فلزی برای رسانایی سطح نمونه است (شکل ۲٫) لایه فلزی نباید در عبور، برگشت و برهم کنش الکترون ها با نمونه اثر بگذارد. بدیهی است که برای هر نمونه ممکن است یک مرحله یا چند مرحله حذف شود ، به طور مثال برای نمونه های خشک همچون تخم گیاهان نیازی به تثبیت و خشک کردن نیست (شکل ۳٫) انجماد سریع بافت های تازه با کمک ابزارهای خاص راهی برای محافظت از ساختارو شیمی بعضی تز نمونه ها است که سطح یخ زده نمونه با اعمال حرارت ملایم قابل حذف است [۳و۱٫]

میکروسکوپ های الکترونی تراگسیل (TEM)
میکروسکوپ های الکترونی تراگسیل با دریافت سیگنال های حاصل از برخورد پرتوی الکترونی به نمونه و عبور آن ، داده های قابل استنادی فراهم می سازند. عبور الکترون از نمونه باعث آشکارسازی اطلاعات داخلی و ساختاری نمونه می شود از این‌رو نیاز به نمونه های خیلی نازک ضروری است. این دستگاه ها ابزارهایی مناسب جهت شناسایی ساختار مواد بلورین و مطالعات ریزساختاری تفصیلی مواد هستند که قادر به ارائه بزرگنمایی زیاد و دارای قدرت تفکیک پذیری بالایی هستند . این امر باعث به کارگیری این دستگاه ها در تحقیقات پیشرفته کانی شناسی ، بلورشناسی ، علم مواد شده است.
نمونه استاندارد در مطالعه و بررسی توسط میکروسکوپ های الکترونی تراگسیل باید داری شرایط زیر باشد:


۱-نمونه تحت آنالیز، مبین کل ماده مورد نظر باشد.
۲-پایداری نمونه باید در مدت آزمایش حفظ شود.
۳-نازک بودن نمونه باید به قدری باشد که الکترون از آن عبور کند.
۴-نمونه باید دارای یال های موازی باشد تا از تغییرات شدید در کنتراست ضخامت اجتناب شود.
۵-عدم ایجاد تغییرات در مدت آماده سازی نمونه
۶-اندود سازی نمونه نارسانا


فراهم آوردن تمامی شرایط دشوار و به ندرت قابل انجام است با این وجود باید تا حد امکان دقــت در امــر آمـاده سـازی نمـونـه لحـاظ شـود. روش‌هـــای گـــونـــاگـــونـــی بـــرای آمـــاده ســازی نــمـــونـــه‌هـــای بــیـــولـــوژیـــک بـــرای مــطـــالــعــات مـیکروسکوپ های الکترونی تراگسیل وجود دارد (جدول ۲٫) یکی از قابلیت های روش ها و تکنیک های جدید ، آماده سازی مجدد نمونه پـس از پـردازش تـوسـط دسـتـگـاه اسـت. در هر صورت، روش های معمول آماده سازی عبارتند از: تهیه لایه و فیلم های بسیار نازک ، تهیه مقاطع نازک و رنگ آمیزی مثبت یا منفی است.


یکی از متداول ترین و مهمترین روش های آماده سازی نمونه ، اولترامیکروتومی است که روشـی اسـتـانـدارد در تـهیه نمونه های بسیار نازک در بیولوژی و همچنین بسیار مفید در آماده سازی نمونه ها برای میکروسکوپ های الـکـتــرونــی تــراگـسـیــل اســت. در ایــن روش بـرش‌هـای کـمتر از ۱*‌۱ میلیمتری با چاقوی الماسه انجام می شود. سپس برش ها را  در یک مایع جمع آوری کرده و پیش از به کارگیری در دستگاه بر یک شبکه قرار می دهند. معمولا نـمـونـه هـای حـاصـلـه نـیـازی بـه آمـاده سازی دیـگـری نـدارنـد هـرچـنـد کـه ضخامت آن ها بستگی به نوع اطلاعات مورد نظر دارد. این روش نیاز به مهارت فراوان دارد و باید توسط یک متخصص با تجربه انجام شود (شکل ۴٫)

میکروسکوپ های نیروی اتمی(AFM)
میکروسکوپ های الکترونی نیروی اتمی به دلـیـل قـابـلـیـت هـای مـنـحصر به فرد آن توسط مـحـقـقـان ” چـشم نانو تکنولوژی ” نامیده شده است [۱٫] میکروسکوپ نیروی اتمی بر اساس نیروی وان دروالسی بین اتمی بنا شده است. این دستگاه به کمک یک پروپ فوق العاده تیز، خصوصیات سطح نمونه را به وسیله نیروی برهم کنشی با اتم های سطح جسم، اندازه گیری می کند و با ثابت نگه داشتن مقدار نیرو در حالی که پروب سطح نمونه را می پیماید ، امکان ایجاد نگاشت ها و تصاویر سه بعدی از سطـح را فـراهـم مـی کنـد. داده هـا و سیگنال های دریافتی در این دستگاه نماینگر اطلاعاتی در مورد ساختار مولکولی و ساختار اتمی نمونه است.
علاوه بر این ،در میکروسکوپ های نیروی اتمی دو قابلیت مهم موجب افزایش و گسترش میزان به کارگیری آن در زمینه بیولوژی و مهندسی پزشکی شده است. یکی محیط داخلی دستگاه است که نیازی به خلاء نداشته و هوا ،گاز و حتی مایع نیز می تواند در آن محیط قرار گیرد. مسلما، این امر استفاده از نمونه های بیولوژی (همانند سلول ها ، پروتئین ها ) به صورت زنده و فعال (حتی خارج از بدن موجود زنده) را امکان پذیر می‌کند (شکل ۵٫)
قابلیت مهم دیگر دستگاه، عدم نیاز به اندود سازی نمونه ها است که موجب حذف مراحل سخت و دشوار آماده سازی نمونه می شود[۳٫] فرایند تصویربرداری از سیال برای این دستگاه مزیتی محسوب می شود که همراه با سایر امکانات دیگرش امکان مشاهده فرایندهای زیستی در زمان واقعی را میسر می سازد.

نتیجه گیری
در میکروسکوپ الکترونی روبشی نمونه تخریب نمی شود اما در رسانا ها نیاز به اندود سازی با کربن برای عدم اتصال الکترون با زمین و در نمونه های بیولوژی با کنتراست پائین که شامل نیتروژن ، اکسیژن ، کربن و هیدروژن هستند نیاز به فلزات سنگین برای آماده سازی نمونه است.
امـا در طـی عملیـات میکـروسکـوپ های الکترونی تراگسیل نمونه دچار تخریب می‌شود و اگر رسانا نباشد باید به وسیله یک رسانا اندود شود. این شرایط بسیار دشوار نیاز به مقاطع نازک ، نازک سازی و قاب گرفتن برای یک نمونه وجود دارد. نمونه بیولوژی با روش تهیـه لایـه هـای بسیار نازک ،تهیه مقاطع نازک و رنگ آمیزی مثبت و منفی لازم است. اما در نمونه میکروسکوپ های نیروی اتمی برای مشاهده نیازی به آماده سازی خاص (استفاده از اندود سازی با کربن و فلزات ) ندارد و نمونه در طول عملیات دچار تغییر یا تخریب نمی‌شود ، آماده‌سازی نمونه نسبت به سایر میکروسکوپ های الکترونی ارزان تر است. در این دستگاه نمونه ها بیولوژی بدون نیاز به شرایط خاص قابل مطالعه و بـررسی  هستند از اینرو در آنالیزها و تحلیل طراحی و ساخت سیستم های مبتنی بر عناصر زیستی ( مانند بیو تراشه ها ) بیشتر مورد استفاده قـرار مـی گیـرنـد.  در جـدول ۳ با ارائه خلاصه جـمـع‌بنـدی و نتیجـه گیـری مبحـث را بـه پـایـان می‌رسانیم.

مهندس سید مرتضی زنده باد

منابع:
[۱]M.Razmara، The Principles & Applications of Electron Microscopy & advanced Analysis. Mashhad، Arsalan، ۱۳۸۴٫
[۲]B.Bhushan، Springer Handbook of Nanotechnology، Springer 2004، The Ohio State University،USA
[3]S.M.Zendehbad، Automation of Analyses of Electronic Microscopy Images of Their Biomedical Structure Surface، Armenia، Yerevan، State Engineering University of Armenia، ۲۰۰۹
[۴]John P. Shields; SEM preparation; University of Georgia; 2007
[5]TEMsamprep – techniques d’aide a la preparation d’echantillon; Transmission Electron Microscopy (TEM) : sample preparation guide ;www.techniques.com
[6]N.Starostina، P.West; Sample Preparation for AFM Particle Characterization;Pacific Nanotechnology 3350 Scott Blvd. Santa Clara، CA 95054،۲۰۰۶