ميكروسكوپ هاي الكتروني؛ ابزاري براي آماده سازي نمونه هاي زيستي

ميكروسكوپ هاي الكتروني ابزاري نيرومند و داراي قابليت هاي فراواني براي تصوير برداري‌،  آشكار سازي و ارائه اطلاعات مفيد درباره  پديده هاي كوچك و بسيار كوچك هستند. اين ابزارها با خانواده هاي متفاوت و عناويني خاص مرتبط با اساس عملكردشان مطرح مي شوند كه از يك سو از لحاظ ساختار و اجزاي داخلي قابل بررسي و ارزيابي اند و از سوي ديگر  از لحاظ روش هاي آناليز و دريافت داده ها از نمونه قابل مقايسه و مطالعه هستند.

آماده سازي و نوع نمونه ها بر اساس ساختار و عــمـلـكــرد پـــردازش اطــلاعــات از نـمــونــه مــتــفـاوت اسـت بـــه طـوريــكــه در بــعــضـي از ميكـروسكـوپ‌هـاي الكتـرونـي آمـاده سـازي به دشـواري و بـا شرايط خاص همراه است و در بعضي ديگر، روش هاي آماده سازي نمونه هاي بيولوژي و غير بيولوژي متفاوت است. داده هاي حاصل از پردازش اطلاعات از نمونه ها، از يك مـنـظــر در ســاخـت و تــولـيــد ريــز تــراش هـا، سيستم‌هاي متنوع الكتروني و الكترومكانيكي اهـمـيــت خـاص دارد و از مـنـظــر ديـگـر در بــه كــارگـيــري نمـونـه هـاي بيـولـوژي ( سلـولهـا، پـــروتـيـــن هــا و…) بـــراي طـــراحـــي و ســـاخــت ريـزتـراشـه‌هـاي زيـسـتـي و سيستم هاي زيستي نانومتري نقش به سزايي را ايفا مي كند.

مــيــكـــروســكـــوپ هـــاي الـكـتــرونــي ابــزاري نـيـرومـنـد و داراي قـابـلـيـت هـاي فـراواني براي تصوير برداري، آشكار سازي و ارائه اطلاعات مفيد درباره پديده هاي كوچك و بسيار كوچك هـسـتند. ابن ابزارها با خانواده هاي متفاوت و عـنـاويـنـي خـاص مرتبط با اساس عملكردشان مطرح مي شوند كه از يك سو از لحاظ ساختار و اجـزاي داخـلي قابل بررسي و ارزيابي اند و از سوي ديگر ، از لحاظ روش هاي آناليز و دريافت داده ها از نمونه قابل مقايسه و مطالعه هستند.
در ميكروسكوپ هاي الكتروني نمونه هاي بيولوژي و غير بيولوژي در دو دسته مشخص و تفكيك شده مورد مطالعه قرار مي گيرند. روش هاي آماده سازي نمونه ، براي هر دسته متفاوت و بر اساس روش كار و پردازش داده ها توسط ميكروسكوپ هاي الكتروني مبتني است. آماده سازي نمونه در بعضي سيستم ها با اندود سازي نمونه با ساير عناصر شكل مي گيرد و در بعضي ديگر با آبگيري و تثبيت همراه است. در هر صورت براي دستيابي به داده ها از نمونه هاي بيولوژي و غير بيولوژي متناسب با روش هاي استاندارد و قابل استناد باشد تا از يك سو اطلاعات كامل و در حداقل خطا باشند و از سوي ديگر نمونه هاي با ارزش و زمان آماده سازي به هدر نرفته و كار با موفقيت به انجام رسد.
اگرچه، ميكروسكوپ هاي الكتروني شباهت هاي اساسي با يكديگر دارند ولي تـفــاوت هـاي قـابـل مـلاحظـه آن‌هـا بـاعـث وجـود گـونـه هـا و خـانـواده هـاي مختلـف (ميكروسكوپ هاي الكتروني روبشي، تراگسيل، كاوشي ) شده است. اين تفاوت بر اساس نوع و روش دستيابي به اطلاعات همانند روش روبش، تراگسيل، كاوش است. علت وجود روش هاي متفاوت، بررسي و مطالعه بهتر و آسان تر و نيز هدفمند نمونه ها است.

فناوري در ميكروسكوپ هاي الكتروني
پيش از ورود به مبحث آماده سازي نمونه ، نگاهي كلي و گذرا بر اصول و روش كار ميكروسكوپ هاي الكتروني اگرچه مختصر امري ضروري است. ميكروسكوپ‌هاي الكتروني براساس ساختار و روش كار ميكروسكوپ هاي نوري ساخته شده اند و از اين‌رو داراي شباهت ها و تفاوت هايي با يكديگرند. اولين مولفه  قابل ارزيابي بين اين دو گروه ، نوع منبع است كه در ميكروسكوپ هاي الكتروني ، الكترون پر انرژي و متمركز براي دستيابي به تصوير و اطلاعات از نمونه به جاي نور مورد استفاده قرار مي گيرد. مـــولـفـــه ديـگـــر ، عـــدســي‌هــاي هـسـتـنــد كــه در مـيـكـروسكـوپ هـاي الكتـرونـي ، عـدسـي‌هـاي الكترومغناطيسي با قابليت تنظيم فاصله كانوني را دارند. با تغيير ميزان جريان الكتريكي، ميزان بزرگنمايي قابل كنترل است. اين درحالي است كه عدسي هاي شيشه اي در ميكروسكوپ هاي نور با فاصله كانوني ثابت فاقد اين توانايي است و در نتيجه اطلاعات قابل دسترسي محدودتري را در اختيار محققان از نمونه قرار مي دهند.
چـگــونـگــي دسـتــرســي و دريـافـت داده هـا ، آشكارسازي و نمايش نتايج حاصله از نمونه، تــوســط مـيـكـروسكـوپ هـاي الكتـرونـي داراي مراحل اساسي مشترك زير هستند:
1-جرياني از الكترون ها توسط منبع الكتروني ايجاد و با استفاده از يك پتانسيل الكتريكي مثبت به طرف نمونه شتاب داده مي شود.
2-جـريـان الـكـتـرونـي بـا كـمـك عدسي هاي مـغـنـاطـيـسـي و دهـانه ها به يك پرتوي تك فام ظريف و متمركز تبديل مي شوند.
3-پرتوي الكتروني حاصل با استفاده از يك عــدســي مـغـنــاطـيـســي در روي نـمـونـه كـانـونـي مي‌شود.
4-برخورد پرتو الكتروني به نمونه سبب بر هــم كـنــش هــاي مـخـتـلفـي در داخـل نمـونـه هـا مي‌شود كه خود پرتو الكتروني نيز تحت تاثير قرار مي گيرد.
5-سيگنال هاي حاصل از اين بر هم كنش ها و آثار آن ، جمع آوري شده تا امكان دستيابي به اطلاعات با ارزش را ميسر سازد[1].
در اين مراحل كلي ، نمايي مناسب از روش كار ميكروسكوپ هاي الكتروني حاصل شد. در هر صورت ، قابليت هاي ممتاز و توانايي هاي زياد ميكروسكوپ هاي الكتروني موجب عدم مـحـدوديـت در اسـتـفـاده و بـه كـارگـيـري آن هـا نـمــي‌شــود. بــه طــور كـلــي  مـهـمـتــريــن عــوامـل مـحــدود‌سـاز شـامـل:  گـران و پـرهـزيـنـه بـودن ، ظرافت و پيچيدگي كاربري ، حساسيت بعضي از مواد، نسبت الكترون هاي پر انرژي و دشواري آماده‌سازي نمونه در بعضي از گروه ها هستند.
گونه هاي متداول و معروف ميكروسكوپ الـكـتـــرونـــي ، كـــه داراي زيـــر مـجـمـــوعـــه هــاي گسترده‌اي نيز هستند عبارتند از : ميكروسكوپ الـكـتــرونــي تــراگـسـيــل  (TEM)، ميكـروسكـوپ الكتروني روبشي (SEM) و ميكروسكوپ نيروي اتمي  (AFM) كه در شكل 1 ترسيمي ساده از كنش پرتو در هر يك از سه ميكروسكوپ مذكور نمايش داده شده است.

ميكروسكوپ هاي الكتروني روبشي(SEM)
ميكـروسكـوپ هـاي الكتـرونـي روبشـي قـادرنـد سيگنـال هـاي حـاصل از برخورد الكترون ها به نمونه (الكترون هاي ثانويه) را به تصويري با كاربردهاي متنوعي تبديل كننـد. اين دستگاه ها معمولا جهت مطالعه ساختارهاي سطحي  يا نزديك به سطح نـمــونـه‌،تهيـه تصـاويـر تـوپـوگـرافيـك ، تعييـن تـركيـب و تصـاويـر تـركيبـي و يـا مطـالعـه كـاتـدولـومـيـنـسـانـس اسـتـفـاده مـي شود. تصاوير در اين دستگاه از آن جهت كه شبيه تصاويري است كه انسان با چشم مي بيند ، خيلي راحت تر تفسير مي شوند [3و2.]
مـعـمـولا بـراي تـهـيـه تصاوير بهينه در آناليز ميكروسكوپ هاي الكتروني روبشي سطوح كاملا پرداخته شده (پوليش) نياز است. مسلما كاهش ميزان آمادگي سطوح موجب كاهش كنتراست و البته كاهش ميزان كيفيت تصوير خواهد شد. از طرف ديگر نمونه ها غير مسطح دشواري هاي زيادي را در آناليز در پي خواهند داشت. با اين وجود ‌،  فضاي بزرگي كه در ميكروسكوپ هاي الكتروني روبشي براي قرار دادن نمونه ها وجود دارد كار با كنترل هاي مكانيكي را آسان مي سازد.
روش هاي تهيه نمونه هاي بيولوژيك براي مطالعات اين سيستم بستگي زيادي به نوع نمونه دارد. بسياري از نمونه هاي بيولوژيك ( خارج از بدن موجود زنده) ، به مرور زمان آب خود را از دست داده ، چروكيده و ديگر به يك بافت و ارگانيسم زنده شباهت نخواهند داشت. اين مسئله باعث مي شود كه سبك هاي ويژه اي براي آماده سازي نمونه‌ها اعمال شود كه به قرار زيرند:
1-نمونه تا حد 5 ميليمتر برش داده شود زيرا محلول هاي تثبيت كننده و خشك كننده به سرعت قادر به نفوذ در نمونه هاي ضخيم تر نيستند.
2-نمونه تثبيت شود ، يعني عوامل شيميايي خاص براي پايداري ساختار نمونه در آب استفاده شود (روش هاي ديگر در جدول 1آمده است.)
3-آب نمونه گرفته شود.
4-مواد خشك كننده از نمونه جدا شود.
5-نمونه با لايه اي در حدود  200ض‌با فلزات طلا يا پالاديوم اندود شود.
6-نمونه به يك قاب استوار و براي مشاهده آماده شود.
اساسا، تثبيت و آبگيري باعث پايداري نمونه هاي نرم و مرطوب مي شود. در صورت عدم تثبيت و آبگيري نمونه هاي بيولوژيك در خلا دستگاه تغيير شكل خواهند داد. بعد از استواري بر قالب آلومينيومي (نمونه هاي بزرگ) يا نواري با لايه پوشاني مضاعف (نمونه هاي كوچك) ، نياز به لايه پوشاني نمونه با يك لايه نازك فلزي براي رسانايي سطح نمونه است (شكل 2.) لايه فلزي نبايد در عبور، برگشت و برهم كنش الكترون ها با نمونه اثر بگذارد. بديهي است كه براي هر نمونه ممكن است يك مرحله يا چند مرحله حذف شود ، به طور مثال براي نمونه هاي خشك همچون تخم گياهان نيازي به تثبيت و خشك كردن نيست (شكل 3.) انجماد سريع بافت هاي تازه با كمك ابزارهاي خاص راهي براي محافظت از ساختارو شيمي بعضي تز نمونه ها است كه سطح يخ زده نمونه با اعمال حرارت ملايم قابل حذف است [3و1.]

ميكروسكوپ هاي الكتروني تراگسيل (TEM)
ميكروسكوپ هاي الكتروني تراگسيل با دريافت سيگنال هاي حاصل از برخورد پرتوي الكتروني به نمونه و عبور آن ، داده هاي قابل استنادي فراهم مي سازند. عبور الكترون از نمونه باعث آشكارسازي اطلاعات داخلي و ساختاري نمونه مي شود از اين‌رو نياز به نمونه هاي خيلي نازك ضروري است. اين دستگاه ها ابزارهايي مناسب جهت شناسايي ساختار مواد بلورين و مطالعات ريزساختاري تفصيلي مواد هستند كه قادر به ارائه بزرگنمايي زياد و داراي قدرت تفكيك پذيري بالايي هستند . اين امر باعث به كارگيري اين دستگاه ها در تحقيقات پيشرفته كاني شناسي ، بلورشناسي ، علم مواد شده است.
نمونه استاندارد در مطالعه و بررسي توسط ميكروسكوپ هاي الكتروني تراگسيل بايد داري شرايط زير باشد:


1-نمونه تحت آناليز، مبين كل ماده مورد نظر باشد.
2-پايداري نمونه بايد در مدت آزمايش حفظ شود.
3-نازك بودن نمونه بايد به قدري باشد كه الكترون از آن عبور كند.
4-نمونه بايد داراي يال هاي موازي باشد تا از تغييرات شديد در كنتراست ضخامت اجتناب شود.
5-عدم ايجاد تغييرات در مدت آماده سازي نمونه
6-اندود سازي نمونه نارسانا


فراهم آوردن تمامي شرايط دشوار و به ندرت قابل انجام است با اين وجود بايد تا حد امكان دقــت در امــر آمـاده سـازي نمـونـه لحـاظ شـود. روش‌هـــاي گـــونـــاگـــونـــي بـــراي آمـــاده ســازي نــمـــونـــه‌هـــاي بــيـــولـــوژيـــك بـــراي مــطـــالــعــات مـيكروسكوپ هاي الكتروني تراگسيل وجود دارد (جدول 2.) يكي از قابليت هاي روش ها و تكنيك هاي جديد ، آماده سازي مجدد نمونه پـس از پـردازش تـوسـط دسـتـگـاه اسـت. در هر صورت، روش هاي معمول آماده سازي عبارتند از: تهيه لايه و فيلم هاي بسيار نازك ، تهيه مقاطع نازك و رنگ آميزي مثبت يا منفي است.


يكي از متداول ترين و مهمترين روش هاي آماده سازي نمونه ، اولتراميكروتومي است كه روشـي اسـتـانـدارد در تـهيه نمونه هاي بسيار نازك در بيولوژي و همچنين بسيار مفيد در آماده سازي نمونه ها براي ميكروسكوپ هاي الـكـتــرونــي تــراگـسـيــل اســت. در ايــن روش بـرش‌هـاي كـمتر از 1*‌1 ميليمتري با چاقوي الماسه انجام مي شود. سپس برش ها را  در يك مايع جمع آوري كرده و پيش از به كارگيري در دستگاه بر يك شبكه قرار مي دهند. معمولا نـمـونـه هـاي حـاصـلـه نـيـازي بـه آمـاده سازي ديـگـري نـدارنـد هـرچـنـد كـه ضخامت آن ها بستگي به نوع اطلاعات مورد نظر دارد. اين روش نياز به مهارت فراوان دارد و بايد توسط يك متخصص با تجربه انجام شود (شكل 4.)

ميكروسكوپ هاي نيروي اتمي(AFM)
ميكروسكوپ هاي الكتروني نيروي اتمي به دلـيـل قـابـلـيـت هـاي مـنـحصر به فرد آن توسط مـحـقـقـان ” چـشم نانو تكنولوژي ” ناميده شده است [1.] ميكروسكوپ نيروي اتمي بر اساس نيروي وان دروالسي بين اتمي بنا شده است. اين دستگاه به كمك يك پروپ فوق العاده تيز، خصوصيات سطح نمونه را به وسيله نيروي برهم كنشي با اتم هاي سطح جسم، اندازه گيري مي كند و با ثابت نگه داشتن مقدار نيرو در حالي كه پروب سطح نمونه را مي پيمايد ، امكان ايجاد نگاشت ها و تصاوير سه بعدي از سطـح را فـراهـم مـي كنـد. داده هـا و سيگنال هاي دريافتي در اين دستگاه نماينگر اطلاعاتي در مورد ساختار مولكولي و ساختار اتمي نمونه است.
علاوه بر اين ،در ميكروسكوپ هاي نيروي اتمي دو قابليت مهم موجب افزايش و گسترش ميزان به كارگيري آن در زمينه بيولوژي و مهندسي پزشكي شده است. يكي محيط داخلي دستگاه است كه نيازي به خلاء نداشته و هوا ،گاز و حتي مايع نيز مي تواند در آن محيط قرار گيرد. مسلما، اين امر استفاده از نمونه هاي بيولوژي (همانند سلول ها ، پروتئين ها ) به صورت زنده و فعال (حتي خارج از بدن موجود زنده) را امكان پذير مي‌كند (شكل 5.)
قابليت مهم ديگر دستگاه، عدم نياز به اندود سازي نمونه ها است كه موجب حذف مراحل سخت و دشوار آماده سازي نمونه مي شود[3.] فرايند تصويربرداري از سيال براي اين دستگاه مزيتي محسوب مي شود كه همراه با ساير امكانات ديگرش امكان مشاهده فرايندهاي زيستي در زمان واقعي را ميسر مي سازد.

نتيجه گيري
در ميكروسكوپ الكتروني روبشي نمونه تخريب نمي شود اما در رسانا ها نياز به اندود سازي با كربن براي عدم اتصال الكترون با زمين و در نمونه هاي بيولوژي با كنتراست پائين كه شامل نيتروژن ، اكسيژن ، كربن و هيدروژن هستند نياز به فلزات سنگين براي آماده سازي نمونه است.
امـا در طـي عمليـات ميكـروسكـوپ هاي الكتروني تراگسيل نمونه دچار تخريب مي‌شود و اگر رسانا نباشد بايد به وسيله يك رسانا اندود شود. اين شرايط بسيار دشوار نياز به مقاطع نازك ، نازك سازي و قاب گرفتن براي يك نمونه وجود دارد. نمونه بيولوژي با روش تهيـه لايـه هـاي بسيار نازك ،تهيه مقاطع نازك و رنگ آميزي مثبت و منفي لازم است. اما در نمونه ميكروسكوپ هاي نيروي اتمي براي مشاهده نيازي به آماده سازي خاص (استفاده از اندود سازي با كربن و فلزات ) ندارد و نمونه در طول عمليات دچار تغيير يا تخريب نمي‌شود ، آماده‌سازي نمونه نسبت به ساير ميكروسكوپ هاي الكتروني ارزان تر است. در اين دستگاه نمونه ها بيولوژي بدون نياز به شرايط خاص قابل مطالعه و بـررسي  هستند از اينرو در آناليزها و تحليل طراحي و ساخت سيستم هاي مبتني بر عناصر زيستي ( مانند بيو تراشه ها ) بيشتر مورد استفاده قـرار مـي گيـرنـد.  در جـدول 3 با ارائه خلاصه جـمـع‌بنـدي و نتيجـه گيـري مبحـث را بـه پـايـان مي‌رسانيم.

مهندس سيد مرتضي زنده باد

منابع:
[1]M.Razmara، The Principles & Applications of Electron Microscopy & advanced Analysis. Mashhad، Arsalan، 1384.
[2]B.Bhushan، Springer Handbook of Nanotechnology، Springer 2004، The Ohio State University،USA
[3]S.M.Zendehbad، Automation of Analyses of Electronic Microscopy Images of Their Biomedical Structure Surface، Armenia، Yerevan، State Engineering University of Armenia، 2009
[4]John P. Shields; SEM preparation; University of Georgia; 2007
[5]TEMsamprep – techniques d’aide a la preparation d’echantillon; Transmission Electron Microscopy (TEM) : sample preparation guide ;www.techniques.com
[6]N.Starostina، P.West; Sample Preparation for AFM Particle Characterization;Pacific Nanotechnology 3350 Scott Blvd. Santa Clara، CA 95054،2006